Voluta da Lorenzo il Magnifico e costruita su progetto di Giuliano da Sangallo fra il 1484 e il 1520, la villa rimase sempre residenza estiva dei Medici e fu teatro di importanti avvenimenti della loro storia dinastica. Qui furono festeggiati i matrimoni fra Alessandro de' Medici e Margherita d'Austria (1536), fra Cosimo I ed Eleonora da Toledo (1539), fra Francesco I e Bianca Cappello (1579). Al tempo di Cosimo III (seconda metà del Seicento) la villa fu dotata di un teatro al piano terra per soddisfare i capricci di Margherita Luisa d'Orléans. Il principe Ferdinando ne fece un attivissimo centro culturale. Alla morte dell'ultimo discendente dei Medici l'edificio passò alla famiglia degli Asburgo-Lorena.  
Modifiche di rilievo furono apportate nel corso del tempo sia alla villa che al parco. Fra il 1865 e il 1871 (periodo di Firenze capitale del Regno d'Italia) vi soggiornarono Vittorio Emanuele II e la Contessa di Mirafiori.
Prototipo della villa rinascimentale, si apre su un ampio parco con annesse limonaia neoclassica e scuderie ristrutturate nel 2000 e adibite a struttura polivalente. La facciata è caratterizzata dall'ampio basamento porticato che circonda l'edificio coronato da timpano. L'ampia scalinata a tenaglia eseguita fra il 1807 e il 1811 su progetto di Pasquale Poccianti, porta al primo piano.
Al piano terreno sono ubicati la sala del teatro, la sala dei biliardi e l'appartamento di Bianca Cappello. Al primo piano si trovano la camera da campo di Vittorio Emanuele (arredata con speciali mobili pieghevoli da accampamento), il salone che ospita i pannelli originali del fregio del timpano, realizzato in terracotta smaltata lungo circa 14 metri. Il salone Leone X si affaccia sul porticato ed è circondato da un imponente ciclo di affreschi realizzati dal Pontormo, Franciabigio, Alessandro Allori e Andrea del Sarto. Oltre il salone si trova la sala dei pranzi, l'appartamento di Vittorio Emanuele e l'appartamento della contessa di Mirafiori e il bagno di realizzazione neoclassica.

Dal 2007 nella villa ha trovato la propria sede il Museo della Natura Morta che è stato allestito in sedici sale del secondo piano ed espone stabilmente circa 200 dipinti dal tardo Cinquecento alla metà del Settecento.
Dal 2013 la villa è stata dichiarata Patrimonio Mondiale dell’Umanità dall’UNESCO.