Sorge su un ampio terrazzamento, sulla sommità del colle di Bonistallo, preceduta da un portico ottocentesco (rifatto nel 1793) che conserva numerose lapidi, la chiesa a unica navata, coperta da una volta a botte ribassata, presenta un interno settecentesco con tele del XVII-XVIII secolo (Matteo Rosselli, ambito del Bilivert, Fra Felice da Sambuca). Sopra le quattro porte laterali, cartelle mistilinee incorniciano rilievi in stucco, nella parte posteriore dell’edificio si addossano la sacrestia e i locali della ex compagnia. La chiesa sorse infatti come oratorio della compagnia delle Stimmate di San Francesco alla fine del XVI secolo e fu completamente ristrutturata nella attuali forme nel 1760-80.
La chiesa ebbe una particolare cura da parte dei Granduchi di Toscana, che nelle vicinanze possedevano la Villa Medicea di Poggio a Caiano. Nell'antica chiesa di Santa Maria Assunta a Bonistallo furono sepolte "in quattro mezzine" le viscere di Francesco I de' Medici e Bianca Cappello, morti proprio alla villa, il cui ritrovamento ha fatto sospettare il loro avvelenamento da arsenico, ipotesi tuttavia non confermata da successivi studi scientifici.